Shabarni Gaffar, S.Si., M.Si. Dr. Maelita R. Moeis Prof. Dr. Soetijoso Soemitro Fakultas: MIPA Sumberdana: HIBAH BERSAING Tahun: 2009 Abstrak: Pichia pastoris telah berkembang menjadi salah satu inang ekspresi untuk memproduksi protein heterolog level tinggi pada penelitian struktur genom dan bioteknologi. Sistem ekspresi ini popular karena tingkat ekspresinya yang tinggi, dapat ditumbuhkan mencapai densitas sel yang tinggi dalam media pertumbuhan yang murah, adanya modifikasi pasca translasi, dan relatif mudah dilakukan peningkatan skala produksi untuk proses industri, serta mampu mensekresikan protein heterolog dengan ukuran lebih besar dari 50 kDa. Beberapa contoh telah membuktikan bahwa P. pastoris dapat memproduksi protein rekombinan dengan level yang tinggi, seperti serum albumin manusia, a-amilase bakteri dan lain-lain. Namun level sekresi beberapa protein rekombinan tertentu masih rendah. Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi level sekresi protein oleh mikroba. termasuk dalam P. pastoris yaitu: jenis kodon dari gen yang diekspresikan, jumlah gen yang digunakan, efisiensi dan kekuatan promoter, efisiensi sinyal translasi, jenis peptida sinyal, proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan hidrolisis protein oleh protease. Semua faktor ini harus dipertimbangkan ketika mendisain sistem ekspresi yang optimum. Walaupun hasil akhir produksi protein sangat dipengaruhi oleh sifat protein, namun hasil dapat ditingkatkan melalui manipulasi faktor-faktor yang mempengaruhi ekspresi protein dan stabilitas produk. Penelitian ekspresi a-amilase S. fibuligera R64 dalam sistem ekspresi P. pastoris oleh kelompok kami telah mendapatkan peningkatan hasil yang cukup signifikan dibandingkan sistem ekspresi S. cerevisiae, yaitu mencapai 5.000 Unit/mL. Akan tetapi hasil yang diperoleh ini masih lebih rendah dibandingkan ekspresi a-amilase B. licheniformis dalam P. pastoris yang mencapai 22.000 Unit/mL. Dalam rangka peningkatan produksi a-amilase dalam sistem ekspresi P. pastoris maka beberapa faktor yang mempengaruhi sekresi protein harus diperhatikan. Penelitian ini dilakukan dengan hipotesis bahwa penambahan salah satu faktor pelipatan protein ke dalam sistem ekspresi P. pastoris akan meningkatkan efisiensi pelipatan protein dalam retikulum endoplasma sehingga akan meningkatkan jumlah sekresi a-amilase pada sistem ekspresi P. pastoris. Peningkatan efisiensi pelipatan protein dilakukan dengan penambahan ekspresi (ko-ekspresi) protein disulfida isomerase (PDI) yang bertanggung jawab pada pembentukan ikatan disulfida untuk menjamin ketepatan pelipatan protein. Jika komponen pelipatan protein tersebut dinaikkan jumlahnya, maka akan diperoleh kenaikan jumlah protein asing yang dihasilkan. Penelitian ini akan dilaksanakan selama dua tahun. Pada tahun pertama akan dilakukan konstruksi vektor ekspresi untuk P. pastoris yang mengandung gen PDI1 dan transformasi P. pastoris rekombinan yang telah mengandung gen pengode a-amilase (ALP1) dengan vektor ekspresi-PDI1. Pada tahun kedua akan dilakukan ekspresi ?-amilase oleh P. pastoris rekombinan, seleksi transforman yang menghasilkan ?-amilase paling tinggi; analisis aktifitas ?-amilase; pemurnian dan karakterisasi ?-amilase. Ko-ekspresi gen PDI1 ini, diharapkan dapat meningkatkan jumlah sekresi ?-amilase oleh P. pastoris secara signifikan. Penelitian tahun pertama telah berhasil mengkonstruksi vektor ekspresi untuk P. pastoris yang mengandung gen PDI1. Pada penelitian ini telah dirancang primer 5